#3. 크로마토그래피

1. 실험 제목 : 크로마토그래피를 이용한 혼합물의 분리

 

2. 실험 목적 : 크로마토그래피로 색소를 분리하는 실험을 하고, 이를 통하여 크로마토그래피 작동원리와 분자의 극성을 이해한다.

 

3. 시약 및 실험기구 : NaCl, 에틸아세테이트-핵세인 혼합물, 셀룰로스, 실리카겔, 4-메톡시페놀, 1,4-다이메톡시벤젠, 4-메틸아니솔

시약명	화학식	몰질량(g/mol)	녹는점(℃)	끓는점(℃)	밀도(g/mL)
염화소듐	NaCl	58.44	801	1413	2.16
에틸아세테이트	C4H8O2	88.11	-83.6	77.1	0.902
핵세인	C6H14	86.18	-95	68	0.6548
셀룰로스	(C6H10O5)n	162.1406			1.5
실리카겔	SiO2ㆍnH2O	60.08	1710	2330	0.7
4-메톡시페놀	C7H8O2	124.1372	52.5	243	1.55
1,4-다이메톡시벤젠	C₆H₄(OCH₃)₂	138.1668	54~56	212.6	1.035
4-메틸아니솔	C8H10O	122.164	-50	174~175	20

실험도구 : 핀셋, 알루미늄 포일, 이쑤시개, 종이, 바이알, 1L 비커, 혼합 용매, 혼합 색소, TLC, 빨대, 가위, TLC용 암막통, UV-램프

 

4. 이론

 

1) 분자의 극성

원자 간 결합의 종류는 극성결합과 무극성 결합, 이온결합으로 나눌 수 있다. 무극성 결합은 동종 원소간에 이루어지는 결합을 가리키고, 극성결합은 서로 다른 전기음성도를 갖는 원자 간에 형성하는 결합이다. 그리고 이 결합들을 어떻게 하느냐에 따라 분자의 극성을 나누는데, 극성 결합의 경우 서로 다른 원자가 결합해 두 원자가 갖는 전기음성도의 차이로 인해 전자가 어느 한쪽으로 쏠리는 ‘극성’을 띄게 한다. 이를 통해 극성을 갖는 극성 분자와 갖지 않는 무극성 분자로 분류하게 된다. 무극성 분자는 같은 원자들의 이원자분자의 경우가 해당되며 이원자분자가 아닌 경우에도 원자들이 결합한 분자의 모형이 서로 대칭을 이루어 쌍극자 모멘트가 상쇄되는 경우가 있다. 예시로 이산화탄소와 메테인이 있다.

 

2) 크로마토그래피

크로마토그래피에는 이동상이라는 개념과 정지상이라는 개념이 있다. 이동상은 크로마토그래피에서 시료를 이동시키는 기체, 액체상을 가리키는 것이고 정지상은 관 속이나 판 위에 고정되어 있으면서 이동상의 용매에 용해되지 않아 시료 성분을 머무르게 하는 성질을 가진 물질을 말한다.

기본적으로 크로마토그래피의 장점은 크로마토그래피는 조작이 간단하고 짧은 시간에 혼합물을 분리할 수 있다느 것이다. 혼합물의 양이 적고, 혼합물을 이루는 성분 물질의 종류가 많아도 한꺼번에 분리할 수 있다.

크로마토그래피의 원리는 시료에 해당하는 혼합물이 이동상의 용매를 따라 이동할 때 혼합물 속 서로 다른 시료가 각기 다른 세기로 정지상의 흡착제와 상호작용하며 이동 속도에 차이를 보이는 현상을 이용하는 혼합물 분리 방법이다. 크로마토그래피가 여러 혼합물을 분리시킬 수 있는 핵심은 혼합물 속 시료가 각기 다른 세기로 흡착제와 상호작용하기 때문이다.

전개액이 무극성일 때 시료가 무극성에 가까울수록 상호작용의 세기가 커져서 비교적 많은 거리를 이동하고 전개액이 극성일 때는 시료가 극성에 가까울수록 비교적 많은 거리를 이동하게 된다.

크로마토그래피는 분류기준에 따라 종류가 다양하다. 그중 판 크로마토그래피와 분리관 크로마토그래피로 나누어 볼 수 있다. 판 크로마토그래피는 지지체를 판을 사용하는 것으로 종이(PC)를 사용하는 것과 TLC판을 이용하는 방식(TLC)이 있다.

분리관 크로마토그래피는 분리관을 이용하는데 액체(LC), 기체(GC)를 이용하는 크로마토그래피와 젤 투과 크로마토그래피(GPC)가 있다.

그리고 시료의 성분을 구분하는데 Rf라는 값을 지표로 사용한다. 이 값은 시료마다 다른 값을 갖는다. (Rf=원점에서 시료가 이동한 거리/원점에서 용매가 이동한 거리)

크로마토그래피에서 시료가 전개액에 녹을 수 있으니 시료는 전개액에 잠기지 않도록 해야 한다. 그리고 잉크는 전개액에 녹으나 흑연은 녹지 않으니 표시를 하거나 선을 그을 때 연필을 사용한다. 그리고 크로마토그래피 중 증발이 일어나 시료가 마르는 등 전개에 영향을 미칠 수 있으니 뚜껑을 닫고 진행하도록 한다.

 

2-1) 종이 크로마토그래피

정지상인 흡착물질로 셀룰로스(거름종이)가 이용된다. 이동상인 전개액으로 NaCl을 사용한다.

정지상인 셀룰로스는 –OH작용기(하이드록시기)를 많이 가지고 있어서 극성을 크게 띄어 극성물질은 극성물질끼리 상호작용이 강한 성질에 따라 극성 화합물과 강한 상호작용을 보이게 된다. 하지만 셀룰로스보다 이동상으로 쓰는 NaCl이 이온결합물질이라 극성이 더 강해 전개에 이용하도록 한다.

 

2-2) TLC

유리판과 알루미늄박을 지지체로 사용하는 크로마토그래피로 미립자 운반체(실리카겔)가 고정상으로 쓰인다. TLC는 실리카겔을 얇고 균일하게 도포시켜 놓은 판이다. 실리카겔은 많은 극성 작용기가 노출되어 있어 극성물질과 상호작용이 강하다. TLC는 전개시간이 짧고 분리능률이 양호한 편이다.

 

3) 색소의 전개

색소를 전개하는데 있어 색소 분자들이 한 분자에서 갖는 극성의 정도가 다르다. 이를 이용해 NaCl 전개액과 상호작용하는 세기에 따라 이동거리가 다르게 나타남을 확인하고 단일 색소는 어떤 색소이고 혼합색소에는 어떤 두 단일시료가 섞여있는지 구분할 수 있다. 크로마토그래피를 시행하고 시료가 이동한 거리를 측정해 이를 우리는 이론값으로서 색소 한 분자에서 모든 극성 원자들의 표면의 합으로 표현하는 물체에서 얼마나 많은 극성 영역이 노출되어 있는지를 나타내는 값인 Polar surface area와 비교하여 색소를 구분하게 된다. Rf 값의 경우 전개액을 극성용매로 할 경우 극성이 가장 큰 파란색이 가장 큰 값을 갖고 가장 작은 빨간색이 가장 작은 값을 가질 것이다

4) 화학 혼합물의 분리

유기물질들은 분자들이 갖는 극성의 정도는 모두 다르다. 이번에는 에틸아세테이트와 헥세인 1:9의 비율로 섞어 무극성에 가까운 성질을 갖는 전개액을 이용한다. TLC 판에 시료를 찍어도 유기물질이라 육안으로 보이지 않으니 UV-램프에 비춰 시료를 확인하도록 한다. 시료가 무극성에 가까울수록 전개액과 상호작용이 강하므로 많은 거리를 이동하게 될 것이다. 극성이 가장 작은 4-메틸아니솔가 Rf 값이 가장 크고 극성이 가장 큰 4-메톡시페놀가 Rf 값이 가장 작을 것이다.

 

5. 실험방법

 

Ⅰ.색소의 전개

크로마토그래피 종이 아래쪽에서 2cm, 위쪽에서 1.5cm 부분에 연필로 가로선을 그어준다.(이때 반드시 연필로 그린다.)

아래쪽에 그은 연필선 위에 색소 시료를 찍을 위치(점)를 연필로 쌀짝 표시해 준다.

연필을 사용하여 단일 색소 3개와 혼합 색소 1개를 지정한 위치에 찍어준다.(시료점의 크기는 작을수록 좋다. 찍을 때 다른 시료와 겹치지 않고 번지지 않게 시료를 찍으면서 말리며 해야 한다.)

색소의 반대편에 이후 지지대 역할을 해줄 빨대를 부착한다.

후드 안에서 전개액으로 이용할 0.1% w/v NaCl 수용액을 1L 비커에 바닥으로부터 높이 1cm(약 50mL)정도 채워준다.(눈금실린더에 담아주면서 1차적으로 50mL에 조금 부족한 양의 경우 스포이트로 옮긴다.)

전개액인 담긴 1L 비커에 시료가 찍힌 크로마토그래피 종이를 넣어 똑바로 세운 다음 알루미늄 포일 뚜껑으로 덮어준다.(크로마토그래피 종이가 흔들리지 않도록 주의한다. 이때 종이에 찍은 시료가 전개액 잠기지 않도록 주의해야 한다.)

충분히 분리될 때까지 전개시킨다.

종이를 빼내어 전개액과 각 시료의 이동 거리를 자로 측정한다.(시료의 이동거리는 진한부분이나 끝점을 표시한다.)

 

Ⅱ.화학 화합물의 분리

TLC 판의 위아래로 1cm 거리에 연필로 선을 그어준다.(반드시 연필을 이용하여 그린다.)

연필선 위로 시료 용액을 찍을 4자리를 점으로 표시한다.(선을 강하게 그으면 TLC 판이 망가질 수 있으니 조심한다.)

UV-램프(254nm로 설정한다.)를 통해 시료가 잘 찍혀있는지 확인한다. 잘 안 찍힌 시료는 다시 찍는다.(유기 물질은 눈으로 구분되지 않아 UV-램프를 이용하여 잘 찍혔는지 확인한다. 이때 시료가 찍힌 부분의 크기는 비슷할수록 좋다.)

후드 안에서 에틸아세테이트와 핵세인을 1:9의 비율로 섞은 전개액을 70mL 바이알에 0.5cm(약 3mL)정도 채워준다.(용액이 휘발되지 않도록 쓰고 뚜껑은 반드시 닫는다.)

바이알에 받침대로 쓸 종이를 넣어주고 시료를 찍은 TLC 판을 전개액이 들어 있는 바이알에 넣고 꾸껑을 닫은 후 눈에 보이지 않으니 전개액이 위쪽 선에 닿을 때까지 전개시켜준다.(이때 흔들리지 않게 주의한다.)

전개가 끝난 뒤 배기후드를 이용해 용매를 날려준다.

UV-램프 아래에서 TLC 판에서 확인된 성분의 위치를 연필로 표시한다.

 

6. 관찰

 

Ⅰ.색소의 전개

크로마토그래피에 이용할 종이에 연필로 선과 시료를 찍을 점을 표시하고 이쑤시개를 이용해 색소를 찍고 있다.

전개액에 NaCl에 종이를 끝부분만 잠기게 넣고 알루미늄 포일 뚜껑을 덮고 충분히 전개를 시켜 색소들이 이동한 거리들이 달리 나타났다. 혼합물의 색소의 경우 단일시료와 이동거리가 비슷한 것이 보인다.

시료의 끝점이나 진한 부분에 연필로 표시를 하고 자를 통해 시료와 전개액이 이동한 거리를 측정한다.

 

Ⅱ.화학 혼합물의 분리

TLC 판에 연필로 선과 시료를 찍을 점을 찍고 이쑤시개를 이용해 시료를 찍는다.

 

UV-램프를 이용하여 시료가 잘 찍혔는지 확인하고 후드에서 전개액을 옮기고 있다.

전개액이 들어있는 바이알에 TLC판을 조심히 시료가 잠기지 않게 넣는다.

전개 이후 배기 후드에서 전개액을 말려주고 UV-램프에서 시료가 이동한 거리의 끝을 연필로 찍어 표시하고 이동한 거리를 자로 잰다.

 

6. 결과

 

Ⅰ.색소의 전개

	1	2	3	4-(1)	4-(2)
계산식	4.6/8.5	7.8/8.5	0.8/8.5	4.2/8.5	7.85/8.5
Rf	0.54	0.92	0.094	0.49	0.92

전개액으로 극성을 갖는 NaCl을 이용했으므로 극성을 가질수록 Rf 값이 클 것이다.

가장 큰 Rf 값을 갖는 2가 파란색이다.

그 다음으로 큰 Rf 값을 갖는 1이 주황색이다.

Rf 값이 가장 작은 3이 빨간색이다.

그리고 4-(1)의 Rf 값은 주황색과 가장 비슷하므로 주황색이 4-(2)는 Rf 값이 파란색과 가장 가까우므로 파란색이라고 할 수 있다. 혼합색소에는 파란색 색소와 주황색 색소가 섞여 있던 것이다.

 

Ⅱ.화학 혼합물의 분리

	1	2	3	4-(1)	4-(2)
계산식	0.5/3	2.5/3	1.5/3	0.5/3	2.5/3
Rf	0.2	0.8	0.5	0.2	0.8

전개액의 경우 무극성을 띄는 핵세인의 비중이 크므로 무극성으로 취급하면 시료가 무극성을 띌수록 Rf 값이 클 것이다.

가장 큰 Rf 값을 갖는 2가 4-메틸아니솔이다.

그 다음으로 큰 Rf 값을 갖는 3이 1,4-다이메톡시벤젠이다.

가장 작은 Rf 값을 갖는 1이 4-메톡시페놀이다.

그리고 4-(1)과 4-(2)는 각각 1과 2와 Rf 값이 비슷하므로 각각 4-메톡시페놀, 1,4-메톡시벤젠이다. 혼합시료에는 4-메톡시페놀, 4-다이메톡시벤젠이 섞여있던 것이다.

 

7. 토의

 

1. 오차 원인 분석 및 결과

화학 혼합물의 경우 같은 물질의 경우 이동 거리가 비슷하게 나옴을 확인할 수 있었다. 그렇지만 색소의 경우 같은 색소임에도 이동 거리에 차이가 존재하였다. 생각을 해보면 이는 혼합색소의 문제라고 생각된다. 화학 혼합물의 경우 유기 물질을 혼합시켜 놓았기에 비교적 정밀한 방식으로 혼합물이 제작되었지 않았을까 한다. 그에 반해 색소의 경우 두 가지 단일 색소가 비슷한 비율로 혼합색소가 제작되지 않았기에 오차가 발생했을 거라 생각된다. 그래서 혼합시료를 종이에 찍을 때 양적이나 농도적인 부분에서 단일시료만을 찍어 크로마토그래피를 했을 때와 차이가 존재할 것이라 생가된다. 이는 혼합시료를 제작할 때 두 색소를 뷰렛이나 피펫 등을 이용해 정밀하게 같은 양을 측정해 혼합하여야 단일 색소와 혼합색소 안에서 같은 색소와 비교해보면 같은 거리를 이동할 것이라고 확인할 수 있을 것이다.

 

2. 이론이 어느 부분에서 적용되었는가?

이번 실험에서 확인할 수 있는 부분은 분자의 극성에 따른 크로마토그래피의 각 시료의 상호작용 세기의 차이였다. 이 상호작용의 세기는 각 분자가 갖는 극성에서 유래하였다. 시료의 분자가 갖는 극성과 전개액이 갖는 극성과의 상호작용에 의한 차이를 구분함으로써 물질을 분리하였다. 색소의 전개에서는 각 색소 분자가 갖는 극성의 차이를 극성 전개액 용매와 상호작용의 세기에서 달리 나타나는 차이에 이용하여 분리할 수 있었다. 화학 혼합물의 분리에서는 전과 달리 거의 무극성을 띄는 전개액을 사용하였는데, 각 유기물질이 갖는 극성의 정도 차이를 이용해 극성을 약하게 띄는 물질일수록 전개액과 상호작용의 세기가 커져 이를 이용하여 물질들을 분리하였다.

 

3. 혼합 물질의 종류가 많아도 어떻게 한번에 분리할 수 있는가?

혼합 물질 안에 여러 시료가 들어있는 경우 한 번의 크로마토그래피를 진행해서 모두 분리되지 않는다. 그래서 크로마토그래피를 시행한 종이나 판을 옆으로 90°를 돌려 한번 더 시행을 한다. 이런 방식으로 한번 더 시행하면 이전 시행에서 분리되지 않은 시료가 분리되게 된다. 이러한 방식으로 여러 번 시행하게 되면 혼합물에 혼합물질의 종류가 많아도 한번에 분리할 수 있게 된다.

 

4. 이번 실험에서 해보지 않은 분리관 크로마토그래피는 어떻게 하는 것일까?

관 크로마토그래피는 고정상을 담는 용기의 모양이 관 모양이다. 이때 고정상으로는 산화알루미늄, 활성탄, 산화마그네슘, 녹말, 셀룰로스 등을 사용하게 된다. 관 모양의 용기에 고정상을 채워 넣고 시료로 사용할 혼합 물질을 넣어주고 나서 흘러나올 밑 부분을 뚫어준 뒤 혼합 물질을 부어주어 혼합 물질의 각 시료들이 모두 관을 통과할때까지 걸린 시간을 측정하여 단위 시간당 관을 이동한 거리를 측정하여 각 시료를 분류하는 방식이다. 이 중 GC는 이동상으로 기체를 이용하는 크로마토그래피이다. 기체-고체, 기체-액체 크로마토그래피로 나뉘고 관을 채우는 고정상으로 기체-고체 크로마토그래피는 흡착제를, 기체-액체 크로마토그래피는 끓는점이 높은 액체를 비활성 운반체에 넣은 것을 고정상으로 사용한다. 이들은 기체 혼합물 시료의 분석과 액체 혼합물 시료의 분석에 각각 이용한다. 기체-고체 방식은 흡착제에 대한 흡착성을 이용해서, 기체-액체 방식은 고정상 액체에 대한 흡수성을 이용한다.